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１.传感器探头的制作 ①在饱和湿度下，将10 mmol/L N-乙酰半胱氨酸水溶液5 μL滴于洁净石英金片的金膜表面，室温放置2 h，使其形成单分子层后，用水彻底冲洗，洗去游离N-乙酰半胱氨酸；②趁金表面未干，立即滴加5 μL 100 g/L的EDC溶液和5 μL 100 g/L的NHS溶液（均以10 mmol/L pH 7.4 PBS配制），放置30 min，用PBS pH 7.4冲洗；③立即滴加5 μL 0.2 g/L亲合素溶液（以pH 7.4 PBS配制），4℃饱和湿度下放置过夜后，用PBS pH 7.4冲洗；④滴加5 μL 0.1 mol/L 乙醇胺溶液（用盐酸调pH至8.0）,室温放置1 h（封闭尚未反应的活泼酯基团），用水冲洗干净；⑤滴加5 μL 10 mg/L 探针A（用10 mmol/L pH7.0 PBS配制），放置1 h后用水洗净；⑥滴加 5 μL 1 g/L 生物素溶液（pH7.0 PBS 配制），放置1 h（封闭亲合素中剩余的生物素结合位点，以防止与第二探针的结合），用水洗净，待用。
2.实验方法
2.1石英金片的处理 将石英金片用新制Piranha 溶液（30%H2O2∶H2SO4,1∶3）〔5〕90℃加热1 h，用纯水（Milli-Q）洗净，分别在纯水-乙醇-纯水中超声5 min〔8〕，用纯水洗净待用。
2.2传感器探头的制作 ①在饱和湿度下，将10 mmol/L N-乙酰半胱氨酸水溶液5 μL滴于洁净石英金片的金膜表面，室温放置2 h，使其形成单分子层后，用水彻底冲洗，洗去游离N-乙酰半胱氨酸；②趁金表面未干，立即滴加5 μL 100 g/L的EDC溶液和5 μL 100 g/L的NHS溶液（均以10 mmol/L pH 7.4 PBS配制），放置30 min，用PBS pH 7.4冲洗；③立即滴加5 μL 0.2 g/L亲合素溶液（以pH 7.4 PBS配制），4℃饱和湿度下放置过夜后，用PBS pH 7.4冲洗；④滴加5 μL 0.1 mol/L 乙醇胺溶液（用盐酸调pH至8.0）,室温放置1 h（封闭尚未反应的活泼酯基团），用水冲洗干净；⑤滴加5 μL 10 mg/L 探针A（用10 mmol/L pH7.0 PBS配制），放置1 h后用水洗净；⑥滴加 5 μL 1 g/L 生物素溶液（pH7.0 PBS 配制），放置1 h（封闭亲合素中剩余的生物素结合位点，以防止与第二探针的结合），用水洗净，待用。
2.3杂交 ① 短链探针B的杂交：取探针B以杂交液（甲酰胺1.8 mL, 20×SSC 1.0 ml, 50×Denhardts 80 μL, 小牛胸腺DNA 80 μL, 1 mol/L pH 7.4 PBS 80 μL, 20%硫酸葡聚糖钠1.0 mL）〔10〕配制成一定浓度的溶液，将制好的传感器探头与此液30℃杂交1 h，分别用杂交洗液A:2×SSC(含0.1%SDS)，B:0.1×SSC(含0.1%SDS)〔10〕各清洗一次，以除去未杂交的DNA。同时作空白对照。②HBV目标DNA（566bp）的杂交：取HBV目标DNA溶液置沸水浴中加热10 min解链，迅速放入冰水浴中冷却，取一定量加入杂交液，加入探针C使成终浓度10 μg/L, 按，均委托上海生工生物工程公司合成，电泳纯化；目标DNA为乙型肝炎病毒（HBV）DNA片段，用PCR增扩，琼脂糖凝胶电泳分离纯化，含566bp，DNA链两端分别与探针A、探针C互补。微弱光测定仪：BPCL型，中国科学院生物物理研究所；1339型固液相分子杂交仪：北京新技术应用研究所。
2.4底物浓度对测定的影响 分别取pH 9.5的NaHCO3/Na2CO3缓冲液500 μL，加入5 μL 1/5000单位/mL的生物素-碱性磷酸酯酶，和不同量的AMPPD，30℃放置30 min，测定其发光强度，结果表明在加入AMPPD量4～30 mL/L时，发光强度与AMPPD加入量近似于直线关系，加入量大于30 mL/L时发光强度趋于平缓。本实验采用AMPPD终浓度10 mL/L。
2.5酶促反应时间对测定的影响 取pH 9.5的NaHCO3/Na2CO3缓冲液500 μL，加入5 μL 1/5000单位/mL的生物素-碱性磷酸酯酶，5 μL AMPPD，立即作发光强度时间扫描，结果表明反应在20～30 min时达到平衡（参见图1），发光强度趋于恒定，因此测定时采用反应30 min。
图1乙醇胺处理前后的比较
Fig.1 Results of treated and untreated with ethanolamine
1,2,5.(空白)未处理(blank)untreated)3,4,6(空白)已处理(blank)treated。
3.3 短链探针B的测定结果
3.3.1 探针B最低检测量 按①在杂交液中分别加入不同量的探针B，使成终浓度为100,10,1,0.1 ng/L，结果见表1。测得本法最低可检测1 ng/L(1.6×10-12 mol/L)浓度的探针B。
3.3.2 探针B加入量与光强的关系 测定了探针B加入量（终浓度10 μg/L～3.2 ng/L）与发光强度的关系，结果见图2。表明在浓度2 μg/L以下时发光强度的变化较小。结果显示DNA的加入量与结果并不成线性关系，推测可能由于DNA的浓度很小时，几乎为分子级，杂交数目限制在分子级水平，但当提高DNA浓度时，杂交数目明显增多，故而表现出一定的正比关系，此时可以对DNA作半定量估计。
图2 探针B的加入量与发光强度的关系
Fig.2 Relation between light intensity and added probe B
3.3.3 测定重复性 测定探针B（终浓度100 ng/L）6次，测得光强度为649，582，363，612，451，平均531，RSD为22.6%。表明本法重复性不够理想，不能用于完全定量，只能作半定量估计，这与文献报道一致〔9〕。
3.4 HBV目标DNA（566bp）的测定结果
按①在杂交液中加入不同量解链后的目标DNA和探针C，使目标DNA的终浓度为500～5 ng/L，结果见表2，表明用本法最低可检测5 ng/L(3×10-14 mol/L)的乙型肝炎DNA片段。
表1 探针B最低检测量测定结果
表2 HBV DNA（566bp）最低检测量测定结果
4 结 论
N-乙酰半胱氨酸在金表面形成单分子自组装层，用EDC、NHS偶联剂将亲合素固定于金膜，再用亲合素/生物素作为固定生物分子的桥，这种固定生物分子的方法在生物传感器领域越来越受到人们的重视〔1～4，6〕。本实验由于采用了酶促反应和光电倍增管两次放大，因而有较高的灵敏度，对于21bp的短链DNA灵敏度可达1.6×10-12 mol/L，对于HBV目标DNA（566bp）可达3×10-14 mol/L。由于采用了溶液杂交，使测定时间可以在2～3 h内完成。本实验的重复性尚不够理想，还无法实现定量，这还有待于进一步的研究。